Construction of a cassette for cloning and analysis of replicons / Construccion de un cassette para el clonamiento y analisis de replicones

The aim of this work was the construction of a cassette, i.e., a non-replicative molecule formed by linkage of an antibiotic resistance gene and a multiple cloning site. This cassette would allow the cloning and analysis of a wide range of replicons. The aac(6')-lc amikacin gene was isolated and ligated to the multiple clining site of the pUC18 vector. This construction was HindIII digested and cloned in the HindIII site of the vector. The resulting pHJ13 clone conferred to the recipient cells the ability to grow in presence of amikacin (cassette marker) and ampicillin (vector gene). By restriction analysis, the cassette orientation was established. Cassette versatility is provided by the presence of the unaltered multiple cloning site segment, and also because it allows sequencing of any replication origin inserted. Cassette funcionality was demonstrated by ligation to a replicative region of H plasmid pHH1457. Presence of the ori region from pHH1457 and the aac(6')-lc gene was confirmed in E. coli transformed clones. The incompatibility properties of the pHH1457 and its capability to replicate in a Poll defective strain were preserved in the pHJII14 construct. Currently, the amikacin cassette is being used in the characterization of H Complex plasmids.

El objetivo de este trabajo es la construcción de un cassette ­ molécula no replicativa ­ formada por un gen de resistencia a un antibiótico y una región de múltiple sitios de clonamiento. Este cassette permitirá el clonamiento y análisis de una amplia variedad de replicones. El gen que determina resistencia a amikacina (aac (6')-Ic) fue aislado y ligado a la región de múltiple sitios de clonamiento del vector pUC18. La construcción resultante fue digerida con Hind III y clonada en el sitio Hind III del vector. El clon pHJ13 resultante confirió a las células receptoras la capacidad de crecer en presencia de amikacina (marcador del cassette) y ampicilina (marcador del vector). Mediante análisis con enzimas de restricción se determinó la orientación del cassette. La versatilidad del cassette se sustenta en la presencia, sin modificaciones, de la región de múltiple sitios de clonamiento, que permitirá obtener la secuencia de nucleótidos de cualquier origen de replicación insertado. La funcionalidad del cassette fue demostrada mediante el ligamiento a una región de replicación del plásmido pHH1457 (Complejo H). La presencia de la región ori de pHH1457 y del gen aac (6')-Ic fue confirmada en clones de E. coli. Las propiedades de incompatibilidad del plásmido H y su capacidad para replicarse en una cepa defectiva en PolI se conservaron en el plásmido pHJII14 construido. El cassette de amikacina está siendo utilizado en la caracterización de plásmidos del Complejo H. P

Trypanosomatidae codon usage and GC distribution

A study od Typanosomatidae GC distribution and codon usage is presented. The codon usage patterns in coincidence with the phylogenetical data are similar in Crithidia and Leishmania, whereas they are more divergent in Trypanosoma brucei and T. cruzi. The analyisis of the GC mutational pressure in these organisms reveals that T. brucei, and to a lesser extent T. cruzi, have envolved towards a more balanced use of all bases, whereas Leishmania and Crithidia retain features of a primeval genetic apparatus. Tables with approximated GC mutational pressure in homologous genes, and codon usage in Trypanosomatidae are presented